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点击次数：4116 发布时间：2020/9/10 14:10:59
上海信帆生物推出：培养细胞的前处理方法
培养细胞的前处理：
1、培养液的测定：
直接吸取培养液，2500转/分，离心10分钟，取上清液进行测定。
[注]：一般建议细胞密度在100万个/ml以上。
2、培养细胞的测定：
①、细胞沉淀的收集：
对于悬浮培养的细胞，通过离心收集细胞沉淀，将细胞悬液1000转/分，离心10分钟，弃上清留细胞沉淀。
对于贴壁培养的细胞，用胰酶将细胞消化下来加入培养基终止消化，或用细胞刮将细胞刮下来；制成细胞悬液，1000转/分，离心10分钟，弃上清留细胞沉淀。
[注]：一般建议收集的细胞数量在100万个以上。
②、细胞沉淀的洗涤：
在细胞沉淀中加入0.5～1ml的等渗缓冲液（推荐 0.1mol/L pH7～7.4磷酸盐缓冲液或生理盐水），轻轻颠倒混匀， 1000转/分，离心10分钟，弃上清留细胞沉淀，重复洗涤2～3次。
③、细胞匀浆液的制备：
在细胞沉淀中加入一定量的等渗缓冲液（等渗缓冲液的加入量根据所测指标的不同而有所改变，一般推荐加入0.5ml，细胞密度不小于100个/ml），混匀，将细胞悬浮于等渗缓冲液中。
[注]：等渗缓冲液推荐使用 0.1mol/L pH7～7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）或生理盐水（0.86%或0.9%）
手动匀浆：用移液器将细胞悬浮液转移至玻璃匀浆管中（2ml玻璃匀浆管），将玻璃匀浆管置于冰水浴条件，手动匀浆， 1分钟/次，间隔30秒，重复6～8次，然后取破碎好的匀浆液进行测定（不离心）。
超声破碎：将细胞悬液置于冰水浴条下，超声破碎：功率300W， 3～5秒/次，间隔30秒，重
复3～5次；取破碎好的匀浆液进行测定（不离心）。
[注]：细胞破碎好以后取出部分匀浆液显微镜观察，如细胞还未破则增加重复次数；
测定相应指标的同时需测一下相应样本的蛋白浓度。
因为很多裂解液都是蛋白变性剂，因此如果老师测定的指标是酶相关的，一般不建议用裂
解液来裂解细胞。
3、培养液及细胞一起处理后测定：
对于悬浮培养的细胞直接进行破碎
对于贴壁细胞用细胞刮直接将细胞刮下来，制成细胞悬液以后进行破碎
[注]：一般建议收集的细胞密度在100万个/ml以上。
手动匀浆：用移液器将细胞悬液转移至玻璃匀浆管中（2ml玻璃匀浆管），将玻璃匀浆管置于冰水浴条件，手动匀浆，30秒/次，间隔30秒，重复6～8次，然后取破碎好的匀浆液进行测定（不离心）。
超声破碎：将细胞悬液置于冰水浴条下，超声破碎：功率300W， 3～5秒/次，间隔30秒，重复3～5次；取破碎好的匀浆液进行测定（不离心）。
[注]：细胞破碎好以后取出部分匀浆液显微镜观察，如细胞还未破则增加重复次数
测定相应指标的同时需测一下相应样本的蛋白浓度。
上海信帆生物推出：培养细胞的前处理方法
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